في عملية إجراء الدراسات الجينية ، غالبًا ما نواجه عينات غير كافية من الحمض النووي الريبي ، على سبيل المثال ، لدراسة أورام الفم التشريحية الدقيقة ، وحتى عينات من خلية واحدة ، وعينات من طفرات جينية معينة يتم نسخها عند مستويات منخفضة جدًا في الخلايا البشرية.بالطبع ، بالنسبة لاختبار COVID-19 ، إذا لم تكن المسحات في المكان المناسب أو لم تكن هناك أوقات كافية أثناء أخذ العينات ، فسيكون حجم العينة منخفضًا جدًا ، وهذا هو سبب ظهور لجنة الصحة وتنظيم الأسرة قبل يومين و اجتاز الاختبار ، وإذا لم يأخذ جهاز أخذ عينات الحمض النووي ست عينات ، فيمكنك الإبلاغ عنه.
حساسية الكاشف مهمة لأن لدينا هذه المشكلة أو تلك المشكلة ، فما الذي يمكننا فعله لتحسين حساسية RT-PCR؟
قبل أن نناقش الحلول الممكنة ، دعنا نذكر تعقدين كبيرين في الموقف الذي ذكرناه للتو.
بادئ ذي بدء ، نحن قلقون بشأن فقدان الحمض النووي الريبي عندما يكون لدينا عدد قليل من مجموعات الخلايا في عينتنا.إذا تم استخدام طرق الفصل والتنظيف التقليدية ، مثل طريقة العمود أو طريقة ترسيب الحمض النووي ، فهناك احتمال كبير بفقدان العينات القليلة.يتمثل أحد الحلول في إضافة جزيء حامل ، مثل الحمض الريبي النووي النقال ، ولكن حتى ذلك الحين ، لا يوجد ضمان بأن تجربة الاسترداد الخاصة بنا على ما يرام.
إذن ما هي أفضل طريقة؟من الخيارات الجيدة للخلايا المستنبتة أو العينات التشريحية الدقيقة استخدام التحلل المباشر.
الفكرة هي تقسيم الخلايا لمدة 5 دقائق ، وإطلاق الحمض النووي الريبي في المحلول ، ثم إيقاف التفاعل لمدة دقيقتين ، ثم إضافة المحللة مباشرة إلى تفاعل النسخ العكسي حتى لا يتم فقد أي من الحمض النووي الريبي ، وأخيراً وضع الحمض النووي الريبي الناتج مباشرة في رد الفعل في الوقت الحقيقي.
ولكن ماذا لو ، بسبب نقطة بداية محدودة أو كمية صغيرة من التعبير الجيني المستهدف ، يمكننا إعادة تدوير كل الحمض النووي الريبي وما زلنا لا نقدم قوالب كافية للحصول على إشارة جيدة في الوقت الحقيقي؟
في هذه الحالة ، يمكن أن تكون خطوة التضخيم المسبق مفيدة جدًا.
فيما يلي مخطط لزيادة الحساسية بعد النسخ العكسي.قبل البدء ، نحتاج إلى أن نسأل المصب عن الأهداف التي نهتم بها ، وذلك لتصميم بادئات محددة لهذه الأهداف للتضخيم المسبق.
يمكن تحقيق ذلك عن طريق إنشاء برايمر مختلط يحتوي على ما يصل إلى 100 زوج من البادئات ودورة تفاعل من 10 إلى 14 مرة.لذلك ، هناك حاجة إلى مزيج رئيسي مصمم خصيصًا لهذا المطلب لتضخيم cDNA الذي تم الحصول عليه مسبقًا.
السبب في تحديد عدد الدورات بين 10 و 14 هو أن هذا العدد المحدود من الدورات يضمن العشوائية بين الأهداف المختلفة ، وهو أمر بالغ الأهمية للباحثين الذين يحتاجون إلى معلومات جزيئية كمية.
بعد التضخيم المسبق ، يمكننا الحصول على كمية كبيرة من cDNA ، بحيث يتم تحسين حساسية الكشف في النهاية الخلفية بشكل كبير ، ويمكننا حتى تخفيف العينة وإجراء تفاعلات PCR متعددة في الوقت الفعلي للتخلص من الأخطاء العشوائية المحتملة.
الوقت ما بعد: 11 أبريل - 2023